發(fā)布時(shí)間：2021-01-05
2021年1月5日，《Nature Cell Biology》期刊在線發(fā)表了題為《通過(guò)內(nèi)源性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的sgRNA監(jiān)測(cè)低豐度轉(zhuǎn)錄本和lncRNAs的表達(dá)》的研究論文，該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類腦研究中心、神經(jīng)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊輝研究組和周海波研究組合作完成。該研究通過(guò)內(nèi)源基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA（single-guide RNAs）表達(dá)，結(jié)合SPH-OminiCMV（CRISPR-activator Suntag-P65-HSF1 and OminiCMV-mCherry）熒光報(bào)告系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)低豐度基因和lncRNAs(Long non-coding RNAs)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)示蹤。該研究建立了一種通用的內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄門控系統(tǒng)，為活細(xì)胞中實(shí)時(shí)標(biāo)記低表達(dá)基因和lncRNAs，研究其生物學(xué)功能提供了有效工具。
在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)內(nèi)源基因活性對(duì)于研究基因的生物學(xué)功能并調(diào)控其表達(dá)水平至關(guān)重要。近年來(lái)越來(lái)越多證據(jù)表明，lncRNAs通過(guò)調(diào)控某些重要編碼基因的表達(dá)，不僅參與了腦發(fā)育、神經(jīng)元分化、突觸可塑性的發(fā)生發(fā)展，而且參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷之后的修復(fù)過(guò)程。深入研究lncRNAs，將為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新思路。但是受現(xiàn)有標(biāo)記技術(shù)的限制，對(duì)其功能注釋極具挑戰(zhàn)性。
監(jiān)測(cè)內(nèi)源基因活性的常規(guī)方法是將熒光蛋白精確插入蛋白編碼框中，但是，這種方法并不適用于非編碼基因和低豐度轉(zhuǎn)錄的基因。sgRNA，類似于一個(gè)GPS可以將Cas核酸酶直接導(dǎo)向目標(biāo)核酸位點(diǎn)，具有高特異性、高效率和多功能性。盡管各種誘導(dǎo)性sgRNA已經(jīng)被開(kāi)發(fā)用來(lái)接收活細(xì)胞中的內(nèi)源信號(hào)，但這些方法只能用于某些功能明確的小RNA的反應(yīng)。目前在活細(xì)胞里面標(biāo)記內(nèi)源基因表達(dá)的方法，都具有一定的局限性，而且，對(duì)于低表達(dá)的基因以及lncRNA，目前缺乏很好的活細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記技術(shù)。 建立適用范圍更廣，能增強(qiáng)內(nèi)源信號(hào)，并且信噪比更低的新型活細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)，是該研究領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題。
楊輝研究組和周海波研究組合作開(kāi)發(fā)了一種廣譜的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄門控開(kāi)關(guān)Ents（Endogenous Transcription-Gated Switch），利用內(nèi)源性啟動(dòng)子表達(dá)sgRNA前體，之后sgRNA前體上的tRNA序列可以被內(nèi)源的自剪切機(jī)制識(shí)別并且切割，進(jìn)而釋放出能夠執(zhí)行功能的sgRNA，當(dāng)Ents與高度敏感的CRISPR激活相關(guān)的報(bào)告系統(tǒng)SPH-OminiCMV結(jié)合，可以監(jiān)測(cè)到內(nèi)源基因的表達(dá)（圖A）。值得注意的是，SPH-OminiCMV-Ents能夠放大內(nèi)源信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)低豐度轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的可視化。
為進(jìn)一步研究SPH-OminiCMV-Ents用于監(jiān)測(cè)內(nèi)源基因的能力，團(tuán)隊(duì)選取了表達(dá)量從高到低的八個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)SPH-OminiCMV-Ents誘導(dǎo)的mCherry表達(dá)水平普遍高于常用的P2A-mCherry標(biāo)記策略，尤其是P2A-mCherry策略標(biāo)記后在熒光顯微鏡下幾乎無(wú)信號(hào)的低豐度表達(dá)基因Sox2、Tet1、Sall4、Tbx3等（圖B）。
為探討增加sgRNA拷貝數(shù)是否會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)熒光蛋白的產(chǎn)生，團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)sgRNA前體，包含六到八個(gè)串聯(lián)的sgRNA拷貝，每個(gè)sgRNA的兩側(cè)分布著tRNA序列（圖C）。研究表明，插入sgRNA陣列可以對(duì)低豐度基因?qū)崿F(xiàn)更好的監(jiān)測(cè)，比如lncRNA Tug1，當(dāng)僅用一個(gè)拷貝的sgRNA的時(shí)候不能監(jiān)測(cè)到其表達(dá)，但使用sgRNA陣列則可以（圖D,E）。
為進(jìn)一步探討此方法的特性，團(tuán)隊(duì)成員建立了一個(gè)可控的Tet-on系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以通過(guò)調(diào)節(jié)Dox的濃度，實(shí)現(xiàn)EGFP基因不同程度的表達(dá)量，進(jìn)而用來(lái)研究報(bào)告系統(tǒng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度是否可以很好地反映目標(biāo)基因的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，報(bào)告系統(tǒng)的mCherry表達(dá)量和EGFP基因的表達(dá)量有很強(qiáng)的相關(guān)性，并且進(jìn)一步探索了此報(bào)告系統(tǒng)和目標(biāo)基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄本水平和蛋白翻譯水平存在的時(shí)間差（圖F）。
為探討此系統(tǒng)是否能夠隨著基因表達(dá)量的增高，其報(bào)告系統(tǒng)也能監(jiān)測(cè)出信號(hào)增強(qiáng)的變化。團(tuán)隊(duì)選取了表達(dá)量在小鼠胚胎干細(xì)胞中表達(dá)量低，但體外分化成神經(jīng)元后表達(dá)量會(huì)增高的Tubb3基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分化后Tubb3的基因表達(dá)量不管是mRNA還是蛋白水平的表達(dá)量均增高，報(bào)告系統(tǒng)中的紅色熒光信號(hào)也隨之增高，能夠反映基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。
該研究創(chuàng)新開(kāi)發(fā)了由內(nèi)源性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的高度可編程的sgRNA門控開(kāi)關(guān)Ents，此系統(tǒng)理論上可以處理任何轉(zhuǎn)錄本的信息。研究人員將Ents與SPH-OminiCMV結(jié)合使用，在小鼠胚胎干細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了對(duì)低豐度基因和lncRNA的可視化監(jiān)測(cè)及其動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測(cè)。該研究為在活細(xì)胞中研究基因元件的功能開(kāi)辟了新途徑，在動(dòng)物個(gè)體水平可用于描繪基因表達(dá)的時(shí)空?qǐng)D譜和標(biāo)記、鑒定特定的細(xì)胞類群，同時(shí)可用于研究天使綜合癥等疾病中l(wèi)ncRNA的表達(dá)模式，構(gòu)建lncRNA體內(nèi)表達(dá)完整圖譜。
該研究由博士研究生高妮、博士后胡靜、賀冰冰、碩士研究生基正邦，以及博士后胡新德，在楊輝研究員和周海波研究員的共同指導(dǎo)下完成，研究組的其他成員積極參與。該研究得到了腦智卓越中心基因編輯平臺(tái)、分子流式平臺(tái)、光學(xué)成像平臺(tái)的大力支持，獲得中國(guó)科學(xué)院、國(guó)家自然科學(xué)基金委、上海市科委的資助。
圖注1：（A）示意圖顯示P2A-mcherry和SPH-OminiCMV-Ents兩種標(biāo)記基因的策略。（B）在mESC細(xì)胞中用SPH-OminiCMV-Ents策略（紅色三角形）和P2A- mCherry策略（綠色菱形）標(biāo)記不同的基因，統(tǒng)計(jì)其mCherry熒光信號(hào)強(qiáng)度以及用qPCR分析這些基因的表達(dá)水平（紫色圓圈，紫色y軸）。（C）示意圖顯示插入一個(gè)sgRNA或一個(gè)sgRNA陣列的標(biāo)記策略。（D，E）Fish圖像顯示對(duì)lncRNA Tug1在3'UTR中插入一個(gè)sgRNA或一個(gè)sgRNA陣列后，細(xì)胞系中mCherry報(bào)告熒光信號(hào)的表達(dá)情況。（F）可控的Tet-on系統(tǒng)示意圖，Dox誘導(dǎo)EGFP-sgRNA前體轉(zhuǎn)錄，成熟的sgRNA釋放出來(lái)激活mcherry報(bào)告系統(tǒng)。
圖注2：（A）在小鼠的胚胎干細(xì)胞上標(biāo)記Tubb3基因，體外分化成神經(jīng)元后，Tubb3基因表達(dá)量升高，標(biāo)記到的紅色報(bào)告熒光也從極低到高。（B）分化前和分化后Tubb3基因和報(bào)告熒光信號(hào)在mRNA水平升高的量化統(tǒng)計(jì)。
研究組之前的研究成果——SPH激活系統(tǒng)：
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